【专题讨论】流式细胞术专区

最近做流式，检测正常人及患者PBMNC各亚群Tim-3的表达，用三色标记，其中（1）管为FITC-CD4/PE-Tim-3/PE-Cy5-CD3；（2）管为FITC-CD8/PE-Tim-3/PE-Cy5-CD3；（3）管为FITC-CD14/PE-Tim-3/PE-Cy5-CD3；（4）管为FITC-CD16+CD56/PE-Tim-3/PE-Cy5-CD3；（5）管为FITC-CD19/PE-Tim-3/PE-Cy5-CD3。操作步骤如下：（1）Falcon管分别标记，加入荧光标记的单克隆抗体（每种抗体10μl）；（2）加入EDTA-Na2抗凝全血100μl，充分混匀，室温避光静置30min；（3）加入红细胞裂解液2ml/管，轻轻振荡，室温避光静置10min；（4）离心800rpm，10min；（5）弃上清，PBS洗涤，离心800rpm，10min；（6）重复步骤（5）；（7）弃上清，加入600μlPBS混匀，上机检测。2周以前出图正常，上周二作图突然出现异常，表现为（1）管CD3/CD4的图标准，外周血淋巴细胞分为CD3阳性群和CD3阴性群，阳性群细胞又分CD4阳性群和CD4阴性群。但CD4/Tim-3的图与CD3/CD4的图完全一致。且不说PBMNC中Tim-3是否能有这么高的阳性率，单以CD4+T细胞而论，不可能全部是Tim-3阳性。其余各管均是一、二通道与一、三通道的图几乎完全相同。已经排除操作过程中加错抗体的可能性，请教各位前辈，还有什么原因可能会导致这样的结果？如何验证？谢谢帮助！祝各位前辈及战友新年快乐，实验顺利！schoman wrote:最好要用一管未处理且完全不染FITC的作对照，另未处理和处理的都染FITC作分析。未处理且完全不染FITC的作对照可以作为阴性对照，同时用于标定流式的仪器参数，未处理的作为阳性对照。然后比较处理后的荧光变化。您好！正在做流式，今天才发现这么好的版块！真是“相见恨晚”！楼主辛苦了！不过晚辈也来打扰了，而且以后可能还有很多问题要不断的来麻烦前辈，向前辈请教，望前辈不吝赐教^_^我检测的是胞内蛋白表达在干预前后表达量的变化，与eming43战友的实验类似，您是说要用“未处理且完全不染FITC的作对照可以作为阴性对照，同时用于标定流式的仪器参数”，不是有同型对照可以作为阴性对照吗？还有您上面说的“未处理的作为阳性对照”这句指的是？看不明白，我想是不是“有处理的作为阳性对照”？望前辈多多指教，谢谢!小弟做外周血，分CD4（PE）与CD8（FITC），CD4T细胞老分不出来。原因何在？ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=288 height=165 title="Click to view full zhy-07.1.111.jpg (288 X 165)" border=0 align=absmiddle>处理细胞为成纤维细胞 ，欲应用流式细胞技术检测细胞核内DNA甲基化水平，间接法，在实验中涉及到两次打孔（胞膜与核膜），请问有哪位战友有具体的操作方法。多谢！处理细胞为成纤维细胞 ，欲应用流式细胞技术检测细胞核内DNA甲基化水平，间接法，在实验中涉及到两次打孔（胞膜与核膜），请问有哪位战友有具体的操作方法。多谢！帮忙看看我的流式做法行不行：大鼠外周血淋巴细胞亚群分析1、由于试验限制，取血肝素抗凝后置于4度保存24小时后检测？？？2、外周血100ul，加入抗体20ui，避光室温孵育20－30分钟3、加入固定液100ul，避光室温孵育20分钟4、加入溶血素1.5ml，混匀，避光室温孵育30分钟，上机检测有老师说最后一不可以多放置一段时间，让溶血素充分作用，利于单核细胞分出。固定后可以放置1－2天检测也不影响结果？？可以吗？？谢谢 4度保存24小时没做过应该是没问题的国外有很多这方面的文献，关于血样的采集于保存的，因为很多时候血样要经过长途运输到参考实验室进行检测，途中样品的保存与处理很重要，你可以找来看一看。关键次cryopreservation preservation FACS等抗体反应时一般冰浴、避光20-30分钟固定后放置1－2天是不影响检测结果的不过我做的时候一般是先溶血洗两到三次，再固定上机。请教：我用组织块准备做流式检测细胞周期，手术室取好标本后剪成直径约2mm大小，2小时后先用机械法没有细胞出来，又用胰酶消化还是没有细胞，只有一些细胞碎片，是什么原因。谢谢！我培养了小鼠骨髓基质细胞，要进行流式检测，可我不知道怎么制备单细胞悬液，这是我的操作步骤，请给予帮助和指正。弃去培养液，PBS洗两次，加入胰酶消化3分钟，在显微镜下观察细胞形态，用含有血清培养液终止消化，吹打，使它充分分散，离心1000rpm/5min，弃去上清，再用PBS重悬细胞，以同样的转速离心一次，再用PBS重悬细胞，细胞计数，调成每毫升含有10的7次方细胞，然后是否要用多聚甲醛固定？谢谢howie 我不能下载你说的那本书Flow Cytometry: First Principles (Second Edition)，你可以发到我的信箱吗? [email protected] 谢谢大家好，我近来正在做流式，6－OHDA不同浓度损伤后测线粒体膜电位，结果发现膜电位变化不明显，但有文章显示，线粒体膜电位应变化很明显（处理因素与我的相同),我想向各位请教一下，流式检测是不是很敏感？有没有也做这方面的师哥师姐，我刚开始做有很多不懂的的地方，请指导一下！非常感谢！我不懂流式，可我在实验中要用到流式细胞术，我想请教哥哥，姐姐，我做的是树突状细胞的流式细胞术，结果每次都不是很理想，每一组都不一样，没有什么趋势。当我们把弱阳性加到强阳性里面去时，结果就会很好，不知道这中将弱阳性加到强阳性里，有没有说服力？插一段, 我想测一下骨髓巨核系的倍体水平,查到如下做法: 单个核细胞悬液与CD61-FITC孵育30 min, 在PBS洗涤后, 用70%(700ml/l)冷乙醇固定, 4℃冰箱过夜。用PBS洗去乙醇,加入含0.002%(0.02ml/l) Triton X 100, 100U RNase和50μg/ml(50mg/l) PI的染液进行DNA染色, 室温避光30 min。以FACSort流式细胞仪读取分析数据, fL1和FL2间的光谱重叠通过调节荧光补偿修正。在FL1对FL2-H点图上设门获取CD61+细胞5000～10000个。用LysysⅡ软件对巨核细胞的DNA倍性分布进行分析.那位大侠给看一下,这样做行不各位GGJJ帮帮小弟！】 小弟最近要做一个试验，使用流式检测细胞表面的某种蛋白质表达情况趋势。小弟以前从来没有做过流式，不知道这个试验怎么样做，希望能够得到各位高手的帮助，谢谢。 小弟以前在论坛上求救过，别人提了一些意见，如下：1. 收集细胞，PBS洗涤两遍2 细胞消化后计数，离心，弃上清3. 根据需要分装进合适数量的EP管（5×10 5-6×10 6每管）4． 离心1000rmp5min足够，弃上清，加入适量的（1%BSA(PBS)按一定比例稀释的一抗（看抗体说明书）一抗，混匀，4度，避光，时间要根据抗体的说明书来定。一般膜表面的抗原30分钟就可以. 孵育要放在冰上避光孵育（PBS稀释一抗，二抗，所用量比孵育PVDF肯定要大，先问抗体公司）5. PBS洗涤两遍，离心，弃上清，加入适量的二抗，混匀，4度(室温)，避光，30分钟6. PBS洗涤后，加入含1％多聚甲醛的PBS，混匀，上机不知道这种方法是否正确呢？小弟还有几个问题要请教：1. 洗涤用的PBS是纯PBS还是含有1％新生牛或BSA的PBS呢？2. “用1%BSA按一定比例稀释的一抗”，是不是还有1％BSA的PBS呢？3. 孵育抗体后是可以直接放入EP管然后上机，还是在抗体孵育后用胰酶先消化细胞然后再放入EP管？4. 1％多聚甲醛是最后一步固定还是最开始就固定？小弟不知道怎么孵育细胞的抗体，希望各位能够给我很多帮助万分感谢！！！！请教那位有有jc-1检测细胞的图？如何解释结果？想要给本科生做个幻灯 不知道怎么解释？ 是不是荧光越小 膜电势越低？ 和用rodamine 123 检测的结果解释一样？qinzhenzhu wrote:我不懂流式，可我在实验中要用到流式细胞术，我想请教哥哥，姐姐，我做的是树突状细胞的流式细胞术，结果每次都不是很理想，每一组都不一样，没有什么趋势。当我们把弱阳性加到强阳性里面去时，结果就会很好，不知道这中将弱阳性加到强阳性里，有没有说服力？做了什么标记呢？CD11c？弱阳性加到强阳性？做FACS时都需要用Isotype标记后设定阴阳性界限（阳性界限设定在阳性率为2％的位置），根据这个阴阳性界限所测得的百分比就是阳性细胞百分率，包括弱阳性和强阳性的细胞yhy1031 wrote:各位GGJJ帮帮小弟！】 小弟最近要做一个试验，使用流式检测细胞表面的某种蛋白质表达情况趋势。小弟以前从来没有做过流式，不知道这个试验怎么样做，希望能够得到各位高手的帮助，谢谢。 小弟以前在论坛上求救过，别人提了一些意见，如下：1. 收集细胞，PBS洗涤两遍2 细胞消化后计数，离心，弃上清3. 根据需要分装进合适数量的EP管（5×10 5-6×10 6每管）4． 离心1000rmp5min足够，弃上清，加入适量的（1%BSA(PBS)按一定比例稀释的一抗（看抗体说明书）一抗，混匀，4度，避光，时间要根据抗体的说明书来定。一般膜表面的抗原30分钟就可以. 孵育要放在冰上避光孵育（PBS稀释一抗，二抗，所用量比孵育PVDF肯定要大，先问抗体公司）5. PBS洗涤两遍，离心，弃上清，加入适量的二抗，混匀，4度(室温)，避光，30分钟6. PBS洗涤后，加入含1％多聚甲醛的PBS，混匀，上机理论上这样来孵育抗体就可以了。但也要根据情况而定，我们最近的一个实验在四度进行抗体标记反而标记不上，改成室温才行，具体原因我也不清楚。需要注意的一点是，有的时候贴壁细胞用胰酶消化的时候，胰酶可能会影响所需检测的细胞表面蛋白与抗体的结合，我们最近的实验就是这样，检测不同细胞表面的同一蛋白的表达，悬浮的细胞可以标记的上，而贴壁细胞不可以，后来消化时将胰酶改为0.03％EDTA，就解决了这个问题yhy1031 wrote:1. 洗涤用的PBS是纯PBS还是含有1％新生牛或BSA的PBS呢？2. “用1%BSA按一定比例稀释的一抗”，是不是还有1％BSA的PBS呢？3. 孵育抗体后是可以直接放入EP管然后上机，还是在抗体孵育后用胰酶先消化细胞然后再放入EP管？4. 1％多聚甲醛是最后一步固定还是最开始就固定？1.最好用含有1％新生牛或BSA的PBS，有助于保持细胞的活性和状态。2.什么意思？就是用含1％BSA来稀释一抗3.是先消化细胞，将细胞处理为细胞悬液，在悬液中进行抗体标记。4.做膜表面蛋白标记，如果马上进行检测，可以不用1％的多聚甲醛固定，直接检测，如果需要保存一段时间后检测，可以在标记完了以后加多聚甲醛进行固定。4度保存。二分之一幸福 wrote:小弟做外周血，分CD4（PE）与CD8（FITC），CD4T细胞老分不出来。原因何在？请问你用的是什么仪器？如果用的是BD 的仪器，你选用的参数就不是很正确，PE是在FL2检测，你做散点图应该用FL1&FL2做散点图。如果是coulter的仪器我不是很清楚，是不是PE就在这个通道检测，如果是，FL1-FL3的补偿从图上看出也没有调节好。可以根据情况看一下是哪里出了问题，祝实验顺利我也做流式检测巨噬细胞的CD68，能否将CD68给我卖一点，我只做2个，谢谢大侠。帮帮忙[email protected]我也做流式检测巨噬细胞的CD68，能否将CD68给我卖一点，我只做2个，谢谢大侠。帮帮忙@126.com回个贴，有分了好看高手的回复 我想用流式细胞做大鼠血液中性粒细胞或单核细胞的内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS)，请问要任何做，标本怎么制备。谢谢流式分析紧求助;PBMC细胞内因子染色CD4/PECY5,IFN-g/PE,IL-4/FITC;设BLANK管(没加剌激剂),多肽管,BCG管,及PMA+Inomycin管;用多肽(0.5ul)或BCG(10ul)或PMA(0.5ul)+Inomycin(1ul)剌激后,表面染色(室温30min),2%多聚甲醛固定(室温,30min),PBS洗两次,加胞内单抗及1%SAPONIN-10%BSA-PBS,染色两小时(因配试制错误,原计划用0.1%,两小时后发现终止).用0.1%SAPONIN-1%BSA-PBS洗两次(感觉有泡没有洗干净),用1%多聚甲醛分散第二天上机.问题一,BLANK出现IL-4达90%(圈定的左下角细胞,FS/SS图与附件的图类似),不知何原因;问题二,BCG剌激图中,发现FS/SS图(附件第二行图)中,圈定的位于左下角的细胞其IL-4达23%(第二行中图),IFN仅0.2%(第二行右图),而其右上位的细胞(附件第三行图)中,IL-4仅18%.现在的问题是,第二行跟第三行分别是什么细胞,为什么产生这种差异?谢谢! （缩略图，点击图片链接看原图）楼主你好，我是一名临床研究生，刚开始接触实验。我打算用流式细胞仪对小鼠的脾细胞悬液进行T细胞亚群进行分析。我想求教一个问题：制成脾细胞悬液后能否保存于4度，或冷冻后复融，再进行标记，上机检测？还有以你的经验，使用哪个公司的抗体比较好？我想检测JURKAT细胞的IFNg的表达,ELISA等检测了是有分泌的,我刺激后加BFA阻断(有P/I与BFA共孵育4-6H,也做过P/I先刺激16H,BFA再刺激4H).FACS怎么我就做不出来呢? 2%多聚甲醛固定(0.1%SAPONIN,2